Ⅰ westernblot的原理是什麼
Western blot是一種蛋白質免疫印跡試驗，其原理在於抗原與抗體的特異性結合。電泳將蛋白分離後，轉移至PVDF膜上，形成抗原-抗體復合物，抗體通過共價鍵吸附於膜上，作為抗原的檢測工具。二抗作為顯色標記，通過底物顯色反應揭示組織和細胞中的蛋白表達情況。
在提取蛋白質時，組織和細胞的處理方式不同。組織提取需要進行預實驗以確定最佳的提取條件，如離心力、時間等，以去除干擾因素，如血液、脂肪等。細胞提取相對簡單，對於貼壁細胞，需先清洗去除培養基，加入RIPA裂解液，通過離心分離提取蛋白；懸浮細胞則需進行離心後，加入RIPA裂解液進行提取。提取全程需保持低溫狀態，以防止蛋白降解。
蛋白質濃度的測定通常採用BCA法，其原理是BCA工作液與銅離子結合形成穩定的紫色復合物，通過562nm波長下吸光度的測量，製作標准曲線，從而計算出蛋白濃度。
蛋白質變性通過加入1*loading buffer煮沸5分鍾實現，此過程破壞蛋白質與其它物質間的非共價鍵，形成帶負電的復合物，便於電泳分離。電泳時，選擇不同濃度的分離膠（8%、12%、15%）以適應不同分子量的蛋白質。電泳條件通常為80V、300mA跑濃縮膠，120V、300mA跑分離膠，恆壓電泳。
轉膜分為濕轉和干轉，濕轉效果更佳，適用於大分子和小分子蛋白的轉移。轉膜條件為220V、300mA，轉膜時間1小時20分鍾，可適用於10-180kDa分子量的蛋白。
發光使用ECL發光液，通過過氧化氫和HRP氧化魯米諾產生熒光，增強劑提高發光效果。發光液的新鮮程度、一抗二抗濃度等影響發光效果。處理條帶時，可利用Photoshop調整對比度，減少後續圖像分析的干擾。ImageJ軟體則用於測量蛋白灰度值。
Western blot的分析包括軟體處理，如Photoshop調整條帶對比度，以及使用ImageJ測量灰度值。BCA法測定的蛋白濃度可能有誤差，可通過內參灰度值進行校正，調整各組上樣量。