⑴ bd流式細胞儀c6 fitc/pe/apc哪個通道
很簡單的啊。
流式細胞儀數據分析
5.1 數據採集及顯示
光信號轉換成電壓脈沖後，再通過模數轉換器轉換成為計算機能夠儲存處理的數字信號。 流式細胞儀的數據以FSC標准格式存儲，該標准由「分析細胞學協會」制定。
根據FSC標准，數據存儲格式應包括三個文件：樣本獲取文件，數據設置文件和數據分析結果。 4參數（FSC,SSC,FITC和PE）的單細胞分析會生成8位數據。當單個樣品累計收集到10000個細胞時，FCS數據文件為80kB.
數據採集存儲完畢後，細胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數如FSC或FITC（FL1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道。縱軸表示在該通道內收集到的細胞數量（如圖5-1）。處在同一通道的每一細胞均符合該通道的信號值，而且具有相同的信號密度。通道右側信號的熒光強度明顯高於左側，越靠右側熒光亮度越強。 圖5-1 流式數據分析圖
雙參數可在二維散點圖中同時顯示，X軸顯示通道1（FL1），Y軸顯示通道2（FL2）。3維圖通過X,Y,Z三個軸分別顯示每個通道的細胞量（如圖5-1）。
習題：數據採集及顯示
1 在直方圖中橫軸和縱軸分別表示 .
2 二維點圖用於顯示 參數。
3 在CellQuest軟體中3維圖中Z軸代表 .
5.2 設門
通過設門的方法可以定義細胞亞群的區域。如：血樣本是混合細胞群，如果想單獨分析淋巴球細胞，可根據FSC或細胞大小，在FSC,SSC的散點圖中設門，其數據結果只反映淋巴細胞亞群的熒光特性。 圖5-2 全血樣本中淋巴細胞亞群的數據分析圖
習題：設門
1 設門的方法通常用於分析樣本內的指定細胞。（對 錯）
5.3 細胞亞群的數據分析
數據分析包括從點圖中的list-mode文件中顯示數據，然後統計點圖中的細胞分布情況。如前所述，分別有幾種形式的點圖用於顯示數據，而且可通過設門的方法區分指定的細胞亞群。 如圖5-3所示，在淋巴細胞亞群周圍設門，以單獨分析或分選該亞群細胞。
圖5-3 選定淋巴細胞亞群設門
門內細胞的數據結果可在隨後的圖中顯示。在下面的實例中，我們將詳盡闡述細胞亞群百分含量的不同分析方法。 我們可以通過單參數直方圖，二維點圖和三維圖來分析結果。單參數直方圖可定位邊界，二維點圖可設置象限標志。如果需要，還可以建立數據統計表以輸出結果。 直方圖可直觀單個參數的細胞數量。陰性對照用於決定直方圖中單參數的左右邊界（見圖5-4）。左圖中M1為陰性對照峰。右圖中M2為CD3 FITC陽性峰。
圖5-4 陰性對照峰M1（NORM001）和CD3 FITC陽性峰M2（NORM002） 圖5-5的統計結果表明，整個事件共記錄了6000個細胞，門內淋巴細胞2891個。其中M1（陰性）細胞619個，M2（CD3陽性）細胞2272個細胞。淋巴細胞亞群CD3陽性百分含量的統計結果為：M2：2272/2891=78.59%.
圖5-5 直方圖統計結果
二維點圖以雙參數顯示結果，每個點表示一個或多個細胞。圖5-6為陰性對照圖，用於設定陰性對照邊界，全圖劃分為四個象限，以區分陰性細胞、單陽性細胞以及雙陽性細胞。左下象限（LL）為雙陰性細胞，左上象限（UL）為Y軸陽性細胞（CD19 PE），左下象限（LR）為X軸陽性細胞（CD3 FITC），右上象限（UR）為雙陽性細胞（CD19+/CD3+）。
圖5-6 陰性對照組（NORM001）和CD3 FITC/CD19 PE雙染樣本（NORM002） 如圖5-7所示，淋巴細胞亞群雙陽性細胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839=10.43%.
圖5-7 散點圖統計結果 另一個分析方法是劃定區域，也就是設門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區域（如圖5-8所示）；然後統計該區域內指定細胞亞群的百分含量。在圖5-9中，R4門內為CD4陽性，CD3陰性的淋巴細胞亞群，其結果為：40/2866=1.40%.
圖5-8 CD3 FITC/CD4 PE 雙染樣本分析圖 圖5-9 CD3 FITC/CD4 PE 雙染樣本數據統計結果
這種方法在分析不同的供體細胞時存在一個缺陷，因為如果事先定義好細胞亞群的區域或邊界，在隨後的文件中，下一個樣本的細胞亞群位置會發生變化，這就需要操作者重新調整區域或邊界位置。 為避免這種情況的發生，我們採用一種稱為集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM軟體就屬於集群分析軟體。該軟體的特點是會隨著整個細胞亞群的移動而移動，自動變換區域或邊界到相應的細胞亞群位置（見圖5-10）。
圖5-10 使用Attractors分析軟體時二維點圖的前後變化對比
5.4 流式細胞儀的其它應用以及數據分析
這些分析方法通常適用於計算離散細胞群的百分含量，對於分析單克隆細胞株分子是否呈陽性並不適用。因為單克隆細胞株是單個細胞群，在大多數情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統計細胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統計結果遠遠大於陰性對照組，那麼我們認為其結果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細胞的表達越高，陽性率越高。 如圖5-11所示，左圖為單細胞群的散射光信號，右圖為陰性對照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個峰的幾何均值分別為2,5和20（從左至右）。
圖5-11 單細胞株分析圖 除檢測陽性率，幾何均值法和中位法還用於分子（接合子）定量分析。
QuantiCALCTM軟體就是使用中值法計算每個細胞的抗體結合位點數。如圖5-12所示，Y軸上的圓圈代表從標准曲線獲取的信息，用於計算每個細胞的接合點位數。 圖5-12 使用QuantiCALC軟體計算每個細胞的抗體結合位點數 我們使用ModFit LTTM軟體進行DNA定量分析。因為DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是離散的，所以我們對曲線以下的面積進行積分，以得到每個細胞亞群的百分含量結果。
圖5-13 細胞周期的DNA直方圖
習題：數據分析
1二維點圖和一維直方圖的作用分別是什麼？
2 見圖5-4和圖5-5,CD3陰性和陽性的百分含量分別是多少。
3 LL象限代表雙陽性細胞亞群。（對 錯）
4 見圖5-6和圖5-7,淋巴細胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。
5 只能使用矩形設定細胞區域范圍。（對 錯）
6 使用區域設定法分析樣本有哪些不足。
7 避免細胞亞群移動的分析方法是什麼。
8 在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測陽性率。
5.5 CellQuest和CellQuest Pro軟體使用
CellQuest和CellQuest Pro軟體是目前運用最為廣泛的流式細胞儀採集及分析軟體。它運行於蘋果電腦上，優質的矢量圖顯示使得操作界面特別優美。現最新的微軟公司的Vista軟體也是仿蘋果操作系統界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro時的強大功能及視覺質感。CellQuest和CellQuest Pro軟體主安裝在BD FACSCalibur型流式細胞儀上。
1.軟體數據流程
在CellQuest和CellQuest Pro軟體的數據流分為二個部分：方案和數據包。方案是指用戶可以建立採集或分析所需的直方圖或散點圖、設門並定義門與門、門與圖之間的邏輯關系。可以使用方案進行數據採集或分析以往已有的數據。每個採集方案分析樣本後會生成數據包，該數據包中包括了樣本中每個顆粒在各個檢測參數上的數值，格式為FCS2.0或FCS3.0.
數據包必須由方案文件打開，無法單獨顯示，或者可由第三方軟體進行分析，如WinMDI.
2.軟體與儀器的連接
流式細胞儀需要加電開啟後會向計算機發出信息，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然後再開啟計算機。
1、\x09先開儀器後開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。
2、\x09在蘋果菜單下點擊CellQuest和CellQuest Pro軟體。
3、\x09從Aquire菜單下選擇connet to cytometer.
3.方案與數據之間的關系
CellQuest和CellQuest Pro軟體的方案與數據相互獨立保存，數據包可以由任一方案文件進行分析，分析後不改變數據包中的任何數據。CellQuest和CellQuest Pro軟體中方案內的直方圖或散點圖有三種狀態：Acquire,Analysis和Acquire-Analysis.
當圖的屬性為Acquire時，此圖只限於採集下用，即只當進行檢測時它才能顯示顆粒；
當圖的屬性為Analysis時，此圖只限於分析已保存的數據包，它不能用於採集數據。
當圖的屬性為Acquire-Analysis時，此圖即可用於採集數據也可用於分析已有數據。
所以方便起見，我們一般將方案中的直方圖或散點圖全部設為Acquire-Analysis屬性。
CellQuest Pro CellQuest
4.方案的建立
A選擇實驗參數
默認情況下，FACSCalibur流式細胞儀開機後只打開一根激光器，及五個參數供選擇使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3.當我們要使用第二根激光器及FL4通道時需要勾選FL4的選項，儀器自動打開633nm激光器。
B,建立散點圖或直方圖，命名坐標
CellQuest Pro軟體主要工作界面，軟體類似於Office word的工作面，可在A4大小的頁面上進行編輯建立各種直方圖或散點圖。
在CellQuest軟體下，需在選擇Plot菜單，選擇Format來打開圖的屬性對話框，其中包括了關於該圖所有選項。
建立好直方圖或散點圖後，我們需要對所選的參數進行命名，如不修改軟體自動命名為FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4.
在菜單上選擇Acquire欄目，選擇Parameter Description,可出現關於文件存儲和參數命名的對話框。在這個對話框中用P字母來代表每個參數，並在此對每個採集參數進行命名，FL1為CD3FITC,FL2為CD4PE……
C,設門並建立門與圖之間的關系
R與G的關系
R是Region的首個字母，Region一般是指一個閉合形的區域，如矩形區、自由區和圓形區。區域與區域之間可以進行邏輯運算，如AND、OR、NOT等關系。當區域進行運算時軟體引進了算術公式的管理概念：
Gate實際了個代數式，簡稱G,其運算式默認如下：
G1 = R1,或G2=R2
當我們要進行邏輯運算時，可變更為G1=R1 AND R2.此時G1就成了一個算術結果了。
G1=R1 AND R2
G2=R1 NOT R2
G3=R1 OR R2
Region List管理門，可以重命名或刪除門。Gate List是對門進行邏輯運算和標識顏色的工具。
建立門與圖之間的關系
打開要編輯的直方圖或散點圖的屬性對話框，選擇Gate選項，選擇門即可。
D,顯示統計參數
5.儀器的操作
當計算機與流式細胞儀聯機後便會出現以下採集控制框：
在有關儀器操作所有控制選項框都在Cytometer下拉菜單下，同時按住「蘋果」鍵及1、2、3、4便可調取所有控制框：
6.文件的保存及調用
實驗或分析過程中所建的方案可以保存下來，通File下拉菜單可以保存這些方案文件：
如要打開這些分析方案只需雙建方案圖標即可；方案可以分析以往的數據包（前提是方案中的直方圖或散點圖都已定義成Acquire-Analysis屬性），有兩種方案打開以往的數據：
方法一：選擇直方圖或散點圖，打開該圖的屬性框（Plot-》Format），見下圖：
在以上紅色框標注的地方選擇要分析的數據包。
方法二：選中方案中所有的直方圖或散點圖，打開Plots菜單，選擇Chang Data File,打開要分析的數據包。